Ontwikkeling van een RT-PCR voor detectie van enterococcen

In de ontwikkeling van een nieuwe RT-PCR-methode voor detectie van enterococcen is in dit onderzoek gekozen voor een selectie van minimaal tien soorten, gemaakt aan de hand van literatuuronderzoek, fecesonderzoek en onderzoek naar de soorten die met de reguliere kweekmethode regelmatig in Nederlands en Belgisch drinkwater opduiken; een inventarisatie gemaakt door de drinkwaterlaboratoria. Vervolgens zijn vier veelbelovende primersets geselecteerd. De resultaten vormen een eerste indicatie dat de nieuwe methoden bruikbaar zijn voor gevoelige en specifieke detectie van enterococcen in drinkwater.

Uitbreiding van bestaande snelle methode

Voor het bepalen van de hygiënische betrouwbaarheid van drinkwater wordt met name de detectie van de fecale indicatororganismen E. coli en enterococcen gebruikt. Hiervoor zijn volgens de Nederlandse wetgeving tijdrovende (ca. 24 uur voor E. coli en 48 uur voor enterococcen) kweekmethoden (NEN-EN-ISO normen) voorgeschreven. Het is belangrijk snelle en betrouwbare methoden te ontwikkelen, allereerst om het risico op blootstelling aan pathogene micro-organismen snel te minimaliseren. Voorts is het noodzakelijk om bij calamiteiten (optreden van besmettingen, ingrepen in het leidingnet) snel te kunnen vaststellen of na de getroffen maatregelen de levering kan worden hervat of dat een kookadvies kan worden opgeheven. Nieuwe RT-PCR-methoden voldoen aan deze eisen. Aan de hand van het genetisch materiaal van indicatororganismen kan binnen 4 uur uitsluitsel worden gegeven over de hygiënische betrouwbaarheid van het drinkwater.

De RT-PCR-methode voor snelle detectie van E. coli is bij alle Nederlandse drinkwaterlaboratoria en de Belgische laboratoria van De Watergroep en Pidpa geïmplementeerd. Validatie hiervan heeft aangetoond dat weinig verschillen bestaan tussen de analyseresultaten verkregen met deze nieuwe methode en met de standaard kweekmethode voor drinkwater (ISO 9308-1).  Naar aanleiding van deze validatie heeft het ministerie van Infrastructuur en Waterstaat de drinkwaterlaboratoria sinds april 2018 toestemming verleend om de RT-PCR als alternatieve methode voor detectie van E. coli toe te passen. Inmiddels zijn ook stappen gezet om de methode binnen de Europese Unie geaccepteerd te krijgen. Hiervoor is het validatierapport bij de European Microbiology Expert Group (EMEG) ter beoordeling aangeboden.

Voor snelle actie na calamiteiten is, naast een methode voor snelle detectie van E. coli, ook een snelle methode voor detectie van enterococcen vereist. Er is al een gevalideerde methode beschikbaar waarmee vier, door de WHO als meest specifiek-fecaal benoemde intestinale enterococcensoorten (Enterococcus faecium, E. faecalis. E. hirae en E. durans), aantoonbaar zijn. Vanwege de beperking tot deze vier soorten worden echter verschillen waargenomen met de kweekmethode, die een groter arsenaal aan enterococcensoorten bestrijkt. Omdat niet kan worden uitgesloten dat een deel van deze verschillen relevant zijn voor het beoordelen van de hygiënische betrouwbaarheid is, na overleg met het RIVM, besloten om de huidige snelle methode uit te breiden zodat hiermee dezelfde enterococcensoorten in drinkwater kunnen worden gedetecteerd als met de kweekmethode. Deze uitbreiding is het onderwerp van dit onderzoeksproject.

Stappen op weg naar de beoogde RT-PCR methode

In dit project zijn de volgende stappen ondernomen:

1. Selectie van enterococcensoorten
   Voor het selecteren van de relevante enterococcen is door alle deelnemende drinkwaterlaboratoria een screening uitgevoerd waarmee is vastgesteld welke soorten worden aangetoond bij de reguliere kweekmetingen door deze tot op soortniveau te typeren met MALDI-TOF-MS. Uit deze inventarisatie zijn, naast de vier “WHO soorten”, zes additionele enterococcensoorten geïdentificeerd die worden aangetroffen in drinkwater en mogelijk van fecale herkomst zijn (zie stap 2).
2. Ontwerpen van primerparen en probes
   Op basis van sequentieovereenkomst van het 16S rRNA gen, zijn de tien geselecteerde enterococcensoorten te verdelen in vier genetisch verwante groepen. Voor het opsporen hiervan zijn in dit onderzoek meerdere potentieel toepasbare primersets ontworpen, zijn de reactieomstandigheden geoptimaliseerd en is de gevoeligheid en specificiteit – op beperkte schaal – getest. Voortkomend uit deze analyses zijn vier veelbelovende primersets geselecteerd. Deze zijn gericht op het 16S ribosomaal RNA gen, voor de tien soorten gevonden in de vorige stap:
   a)     De vier soorten zoals benoemd door de WHO: E. faecium, E. faecalis, E. durans en E. hirae.
   b)    Minimaal de zes additionele soorten afkomstig uit de inventarisatie: E. casseliflavus, E. mundtii, E. gallinarum, E. moraviensis, E. haemoperoxidus en E. avium.
3. Optimalisatie van reactieomstandigheden
   Er wordt verder gegaan met de meest belovende primerparen uit stap 2. De reactieomstandigheden van de RT-PCR-analyses worden geoptimaliseerd tot efficiënt verlopende reacties waarmee alleen detectie van het doelorganisme plaatsvindt.
4. Beperkte validatie
   a)     Een beperkte validatie wordt uitgevoerd om vast te stellen of de geselecteerde enterococcen kunnen worden aangetoond met voldoende specificiteit en gevoeligheid. Als uit deze beperkte validatie blijkt dat de methode naar verwachting voldoende specifiek en gevoelig is, zal deze in een vervolgtraject uitgebreid gevalideerd moeten worden volgens ISO 16140-2.
   b)    Bepaling van de detectielimiet van de methode voor de verschillende “target” enterococcensoorten.
   c)     Inclusiviteit/exclusiviteit op een beperkt aantal stammen

De inclusiviteit van de ontwikkelde methode wordt onderzocht op een set van minimaal 30 stammen. Voor een zo goed mogelijk beeld van de detecteerbaarheid gaat het hierbij om zowel stammen die tot de tien geselecteerde enterococcensoorten behoren als andere enterococcensoorten.

Exclusiviteit van de ontwikkelde methode wordt onderzocht door uitvoering van RT-PCR analyses op een beperkt aantal bacteriestammen die kunnen voorkomen in water en verwant zijn aan enterococcen (zoals o.a. streptococcen en aerococcen).

Geslaagde RT-PCR ontwikkeling

Wanneer op verdunningen van monsters met bekende enterococcensoorten de RT-PCR methode wordt toegepast, is het in potentie mogelijk om de tien geselecteerde soorten met voldoende gevoeligheid te detecteren. Dat de nieuw ontwikkelde methode voldoende specifiek is, blijkt uit het feit dat deze wel aanslaat op het RNA van de geselecteerde enterococcensoorten en niet op het RNA van bacteriën die vallen buiten het enterococcengeslacht. In tien drinkwatermonsters, afkomstig van verschillende locaties, waarin met kweek geen enterococcen zijn aangetoond, was dit ook het geval met RT-PCR. Deze resultaten vormen een eerste indicatie dat de nieuwe methoden bruikbaar zijn voor gevoelige en specifieke detectie van enterococcen in drinkwater.

Om vast te stellen in hoeverre de resultaten met RT-PCR gelijkwaardig zijn aan resultaten verkregen met de kweekmethode is een uitgebreide validatie volgens ISO 16140-2:2016 noodzakelijk. Voordat dit validatietraject van start gaat is het belangrijk te onderzoeken of de primersets zijn te combineren. Daarmee wordt detectie van de tien soorten in één reactie mogelijk (“multiplex RT-PCR”). Deze multiplex RT-PCR maakt validatie en toepassing van de methode eenvoudiger en minder kostbaar. Daarnaast is het, met het oog op bepaling van de “Relative Limit Of Detection (RLOD)”, van belang om over nauwkeurig gekwantificeerde celsuspensies van enterococcen te beschikken. Voor het samenstellen hiervan is de ontwikkeling van een robuuste methode noodzakelijk.